Педиатрия инфракрасный спектральный анализ сыворотки крови как отражение уровня нарушения метаболических процессов при инфекционной патологии у детей часть 1

В основе спектроскопических методов лежит измерение зависимостиинтенсивности поглощения, испускания или рассеяния света веществомот частоты света (или длины волны). В оптической спектроскопиииспользуются спектры поглощения в инфракрасной и ультрафиолетовойобластях, а также спектры комбинационного рассеяния света и спектрылюминесценции. Каждому спектру соответствует определенная областьдлин волн. В разных областях поглощение света имеет различнуюприроду. При поглощении энергии в пределах оптического спектраможет изменяться вращательная, колебательная энергия молекулыили энергия возбуждения внешних, валентных электронов. Для повышениявращательной энергии молекулы достаточны относительно небольшиеэнергии - соответствующее поглощение лежит в далекой инфракрасной(ИК) - области (области больших длин волн). Для увеличения колебательнойэнергии молекулы (для возбуждения колебаний атомов относительнодруг друга) требуются кванты большой величины и поглощение лежитв близкой ИК-области. Еще большие кванты энергии требуются длявозбуждения внешних электронов молекулы - поглощение в видимойи УФ-области.

Метод спектроскопического анализа позволяет определить количествотого или иного вещества. Закон Бера - один из основополагающихзаконов спектроскопии, гласит: "Поглощение света пропорциональночислу молекул поглощающего вещества на его пути".

В ИК-спектре различают четыре области: 1. видимая, 2. близкая,3. фундаментальная и 4. далекая. Для исследования органическихвеществ наибольшее значение имеет фундаментальная инфракраснаяобласть, лежащая в диапазоне от 5000 до 200 см^-1. Линиив области 600-1300 см^-1 отличны и специфичны даже дляродственных молекул, поэтому ее называют областью "отпечатковпальцев" молекулы. В эту область попадают валентные колебанияодинарных связей С-О, С-N, N-О. Напротив, частоты поглощения двойныхсвязей С=С, С=О, N=О характеристичны, т.е. мало отличаются дляразных молекул и лежат в области 1500-1950 см^-1. Поглощениетройных связей находится в еще более коротковолновой области (дляС=С при 2100-2250 см^-1). ИК-спектр является абсолютноспецифическим свойством каждого химического соединения, поэтомудаже изомеры положения, геометрические изомеры и молекулы, содержащиепротоны, обладают различными спектрами. В связи с этим ИК-спектркаждого вещества имеет отчетливую индивидуальность (fingerprint).

ИК-спектры применяются для идентификации соединений и установлениястепени их чистоты (качественно), а также они могут быть использованыдля качественного анализа смесей при контроле над ходом реакции.Однако наиболее распространенное и важное применение ИК-спектровэто выяснение и подтверждение предполагаемого строения соединений.Наличие почти любой функциональной группы в молекуле можно установитьс их помощью. Кроме того, уже упоминалось о возможности проведенияметодом ИК-спектроскопии и количественного анализа.

Современные приборы "записывают" спектр автоматически,а ИК-спектрофотометры "Specord 80/85 IR" обеспечиваютфотометрическую точность ±0,2%. Контрольная программа встроенногокомпьютера не допускает неправильных и несовместимых параметров,обеспечивает графикопостроение и линейную корреляцию базиснойлинии между 10 волновыми числами. Перечисленные факторы обеспечиваютобъективность и высокую точность спектроскопических анализов.Согласно современным представлениям основу клеточной мембранысоставляет двойной слой фосфолипидов, обусловливающий присущиемембране свойства жидкого кристалла. Нарушения структуры и функцииклеточных мембран на всех этапах болезни являются главным выражениемпатологии при состояниях, сопровождающихся токсикозом. Роль патологииклеточных мембран и метаболизма, как составных звеньев токсикоза,отражается в большом количестве работ. Как известно генерализованныерасстройства микроциркуляции, присущие патогенезу заболеваний,протекающих с токсикозом, являются причиной гипоксии. Нарастающаятканевая гипоксия приводит к изменению межклеточного веществаи клеточных мембран. В свою очередь, в механизмах развития патологиимембран ведущее место отводится гипоксическим нарушениям метаболизмаклеток. В результате чрезмерное накопление кининов, биогенныхаминов, протеаз и липаз, лизосомальных гидролаз, продуктов перекисногоокисления липидов, свободных жирных кислот, а также патологическихмиокардио-депрессивных веществ формирует циркуляторную недостаточность.Чрезмерное накопление перечисленных агентов определяет синдромтоксемии и вызывает повреждение практически всех функций и систем,включая сократимость миокарда, тонус сосудов, реологические свойствакрови и т.д. В конечном итоге тканевая гипоксия нарушает путибиологического окисления. Страдают цикл Кребса и окисление глюкозыв системе пентозного шунта. Основным путём получения энергии становитсяанаэробный гликолиз с образованием молочной кислоты как конечногопродукта. Лактатацидоз, стимулируя накопление НАДН, тормозит ферментыгликолиза (фосфорилаза, фосфофруктокиназа) и снижает активностьэтого пути окисления, возникает тяжёлый энергодефицит с истощениемзапасов макроэргов.

Одним из следствий дефицита энергии является накопление ионови молекулярных частиц (ОН^-, Н+, НОО+ и др.), которыеприводят к окислительному повреждению полиненасыщенных жирныхкислот, входящих в состав липидов мембран [1, 2, 3 ]. Перекисилипидов, в свою очередь, оказывают своё разрушительное действиеи на основные макроэргические соединения АТФ, подвергающегосяусиленному распаду до АДФ, АМФ и аденозина.

Существующий уровень знаний в области спектроскопии позволяетопределять появление новых ("патологических") и исчезновение"нормальных" химических веществ (АТФ, ГТФ, УТФ и др.),которые при различных патологических состояниях подвергаются быстромуметаболизму, с образованием соответствующих продуктов гидролиза- монофосфатов. Также возможно определение концентрации белковыхмолекул и фосфатидов в процессе распада клеточных структур. Висследуемую зону ИК-спектра попадают и валентные связи свободныхрадикалов.

Таким образом ИК-спектроскопия позволяет определить уровень рядаметаболитов, образующихся в процессе патологических изменений,инициированных токсикозом и, соответственно оценить степень нарушенияметаболических процессов.

На наш взгляд наиболее важным является не определение количестватого или иного вещества (учитывая огромное их количество), находящегосяв крови больного ребёнка, а корреляция интегративных показателейИК-спектроскопического анализа со степенью выраженности токсикозаи, следовательно, уровнем метаболических нарушений. В процессеисследования под наблюдением находилось 183 ребёнка в возрастеот 1 года до 14 лет с различной инфекционной патологией. У 113детей диагностирована токсическая дифтерия ротоглотки (ТДР), у14 - локализованная дифтерия ротоглотки (ЛДР), у 44 детей выставлендиагноз - ангина (фолликулярная или лакунарная) и у 12 - инфекционныймононуклеоз (ИМН). Кроме того, для сравнения была взята группаздоровых детей, состоящая из 30-ти человек. По возрастному и половомусоставу данные группы детей соответствовали друг другу.

В качестве субстрата для исследования использовали сывороткукрови больных (здоровых) детей, приготовленную для проведенияспектрального анализа. Сыворотку высушивали при комнатной температурена полуприкрытой чашке Петри. Сухой остаток вводили в вазелиновоемасло и получали суспензию, которую затем подвергали ИК - спектроскопиис регистрацией спектров поглощения в области 1200-1000 см^-1.При получении спектрограммы определяли высоту пиков полос поглощенияс максимумами при 1170, 1165, 1150, 1140, 1130, 1100, 1070, 1025см^-1 и вычисляли среднее значение высоты всех пиков- С. Затем определяли отношение каждого предыдущего пика к последующему:1170/1165, 1165/1150, 1150/1140, 1140/1130, 1130/1100, 1100/1070,1070/1025. Информативные показатели обозначали условными символами(M, m, D, c, R, x, S). Показатель М представляетсобой наибольшее полученное частное, а показатель м - наименьшее.Кроме того был введён дополнительный показатель - D, являющийсяразностью М и м. Среднее значение всех частных обозначено,как показатель - с. Также вычисляли величину R -отношение высоты пика с максимумом при 1165 см^-1 квысоте пика с максимумом при 1170 см^-1, величину x- отношение высоты пика с максимумом при 1130 см^-1к среднему значению величины высот пиков (С) и величинуS - отношение высоты пика с максимумом при 1100 см^-1к среднему значению величины высот (С).

Первоначально было проведено сравнение показателей ИК-спектроскопическогоанализа сыворотки крови здоровых детей и детей с различной инфекционнойпатологией, протекающей с синдромом ангины (табл. 1). Еслирассматривать приведённые нозологические формы применительно кстепени выраженности интоксикации, то следует согласиться, чтонаименее выраженный токсический синдром должен наблюдаться приЛДР. Далее, по мере возрастания уровня интоксикации, заболеваниярасположатся в следующем порядке: ИМН, ангины и ТДР. На наш взгляд,такая градация обусловлена клинико-патогенетическими сведениямио каждом из заболеваний. Конечно, у отдельно взятого больногос ИМН уровень интоксикации может быть более выраженным, чем уконкретного больного ангиной, но на группе больных степень выраженностивсех симптомов и синдромов усредняется. Соответственно у здоровыхдетей синдром интоксикации отсутствует. Известно, что нарушениеметаболических процессов в организме нарастает по мере углублениятоксикоза и эти две переменные величины имеют чёткую положительнуюкорреляционную взаимосвязь.

Таблица 1. Показатели ИК-спектроскопии здоровых детей и приразличных инфекционных заболеваниях, протекающих с синдромомангины.

Нозологическая форма (здоровые)	Показатели ИК-спектроскопии
	M	м	c	D
1. здоровые дети	1,8±0,074	0,5±0,019	±	1,4±0,086
2. локализованная дифтерия	1,6±0,196	0,3±0,046	1,0±0,099	1,3±0,24
3. инфекционный мононуклеоз	1,9±0,333	0,3±0,066	1,0±0,066	1,6±0,394
4. ангины	1,3±0,052	0,5±0,020	0,9±0,026	0,8±0,064
5. токсическая дифтерия	1,4±0,053	0,5±0,017	0,9±0,023	0,9±0,064
	S	R	x
1. здоровые дети	0,6±0,015	0,6±0,023	0,7±0,019
2. локализованная дифтерия	0,8±0,086	0,3±0,071	0,8±0,044
3. инфекционный мононуклеоз	0,8±0,068	0,4±0,081	0,8±0,069
4. ангины	1,1±0,052	0,6±0,045	0,9±0,044
5. токсическая дифтерия	1,1±0,026	0,6±0,029	0,9±0,022

При рассмотрении таблицы прослеживается тенденция постепенногоснижения числовых значений показателя M по мере возникновенияи нарастания токсикоза (от здоровых детей к ТДР). Обратная (увеличениечислового значения параметра), более чётко выраженная тенденция,отмечается у показателей S и x. Предположительноназванные параметры - S, x и, в меньшей степениM, отражают уровень изменения метаболических процессов, находящийсяво взаимосвязи со степенью интоксикации.

Кроме того, табл. 1 показывает, что при ТДР и ангинах, показателиИК-спектроскопии имеют сходные значения, аналогичная ситуацияимеет место при ЛДР и ИМН, а именно в таком порядке заболеванияболее сопоставимы по степени выраженности интоксикации.

С целью выяснения нормальных значений ИК-спектроскопических параметров,определили их диапазон у здоровых детей. Для этого выбрали минимальноеи максимальное значение каждого из показателей (табл. 2).

Таблица 2. Наименьшее и наибольшее числовые значения параметровИК - спектроскопии у здоровых детей.

Значение	Показатель ИК- спектроскопии
	D	M	m	R	S	x
min	0,55	1,23	0,30	0,43	0,50	0,45
max	2,50	2,88	0,70	0,88	0,80	0,86

Затем определили количество детей (в %) при каждой нозологическойформе, у которых числовые значения параметров выходят за пределыпринятой нормы (для каждого из параметров). Данные представленына таблице 3. Следует отметить, что если числовые значения ИК-спектроскопическихпараметров ребёнка будут выходить за приведённые в таблице 2,мы можем с уверенностью отнести его к группе больных, т.к. у здоровыхтакие числовые значения не зафиксированы.

Таблица 3. Число детей (в %), имеющих отклонение от нормальныхзначений показателей ИК-спектроскопии, при инфекционных заболеваниях,протекающих с синдромом ангины.

Нозологическая форма	Показатель ИК-спектроскопии
	D<0.55	M<1,23	m<0,30	R<0,43	S<0,50	x<0,45
с-м ангины (все больные)		40,5	23,7	28,4	4,2	6,7
ЛДР		28,6	57,1	64,3	14,3	0,0
ИМН		33,3	58,3	58,3	8,3	8,3
ангина		45,5	9,1	22,7	6,8	11,5
ТДР	30,8	40,8	21,7	23,3	1,7	3,3
Нозологическая форма	Показатель ИК-спектроскопии
	D>2,50	M>2,88	m>0,70	R>0,88	S>0,80	x>0,86
с-м ангины (все больные)		2,6	4.7	10,0	69,5	68,9
ЛДР		7,1	0,0	7,1	50,0	35,7
ИМН		25,0	0,0	0,0	50,0	41,7
ангины		0,0	4,5	18,2	79,5	59,1
ТДР	0,8	0,8	5,8	8,3	80,8	68,3

Примечание: в первой графе (все больные) основнуюмассу составляют дети с ТДР и ангинами.

Как видно из таблицы, показатели D, M, mи R при возникновении инфекционного заболевания имеют тенденциюк снижению (преимущественно у больных располагаются ниже min),в сравнении со здоровыми детьми, а S и x, наоборотпреимущественно повышаются по отношению к норме (преимущественновыше max). Как уже отмечалось выше, тенденции поведения ИК-параметровсходны при ТДР и ангине, с одной стороны и при ЛДР и инфекционноммононуклеозе, с другой. Находит подтверждение и другая замеченнаятенденция - увеличение количества больных с повышенными, по отношениюк здоровым детям, числовыми значениями параметров S и х,по мере увеличения уровня интоксикации (р<0.05-0.01). Имеетсяи некоторая тенденция увеличения количества больных с пониженнымзначением показателя M, с 28.6% при ЛДР до 40.8-45.5% приТДР и ангинах. Выявленная взаимосвязь изменений числовых значенийпараметров ИК-спектроскопии и выраженности интоксикации, присущейтому или иному инфекционному заболеванию, позволяет сделать вывод,что данный анализ является интегральным показателем, отражающимуровень нарушения метаболизма. Однако, безусловно, необходимоболее подробно рассмотреть поведение параметров ИК-спектроскопиипри ТДР. В таблице 4 приведены числовые значения параметров ИК-спектроскопиипри различных клинических вариантах ТДР. Как видно из таблицы,сами числовые значения мало отличаются при разной степени ТДР.Данный факт можно объяснить тем, что степень ТДР выставляетсяна основании формального признака - выраженности ОПКШ и не всегдасоответствует истинной тяжести патологического процесса. В связис этим целесообразно рассмотреть числовые значения показателейв зависимости от исхода ТДР (табл.5).

Таблица 4. Показатели ИК-спектроскопии при различных формахтоксической дифтерии у детей

Клинический вариант ТДР	показатели ИК-спектроскопии
	М	м	с	D
1.субтоксическая	1,3±0,063	0,5±0,028	0,9±0,035
2.токсическая 1ст.	1,5±0,114	0,5±0,034	0,9±0,037
3.токсическая 2ст.	1,4±0,182	0,6±0,026	0,9±0,078
4.токсическая 3ст.	1,4±0,060	0,4±0,036	0,9±0,031
	S	R	x
1.субтоксическая	1,2±0,041	0,7±0,062	1,0±0,039
2.токсическая 1ст	1,1±0,061	0,7±0,059	1,0±0,039
3.токсическая 2ст	1,2±0,047	0,6±0,043	1,0±0,033
4.токсическая 3ст	1,0±0,053	0,5±0,050	0,8±0,050

Таблица 5. показатели ИК-спектроскопии в зависимости от исходатоксической дифтерии у детей (М±м).

Исход ТДР	показатели ИК-спектроскопии
	М	м	с	D
выжившие	1,33±0,06	0,52±0,02	0,85±0,03
умершие	1,72±0,04	0,23±0,03	1,06±0,03
р	<0,001	<0,001	<0,001
	S	R	x
выжившие	1,15±0,03	0,65±0,03	0,98±0,02
умершие	0,91±0,07	0,34±0,07	0,72±0,08
р	<0,001	<0,001	<0,001

В этом случае, как показывет таблица, определяется достоверное различиечисловых значений параметров ИК-спектроскопии у выживших и умершихдетей.

Корреляционный анализ выявил, что если показатель - спо мере ухудшения прогноза растёт, то показатели - м их снижаются при возможности летального исхода. Тенденциюпоказателя с в несколько меньшей корреляционной зависимостиповторяет максимальное значение (М). Уровень корреляцииэтих показателей достоверен (р<0,05-0,001). Показатели Sи R повторяют тенденцию минимального значения (м)и х. Таким образом, при ТДР сохраняется та же закономерностькорреляционных взаимосвязей, которая определяется при ЛДР, ИМНи ангинах. В данном случае - корреляция параметров ИК-спектроскопиис исходом болезни - также рассматривается их поведение по меренарастания степени токсикоза, но уже внутри группы больных с ТДР.

Таким образом, изменение числовых значений параметров ИК-спектроскопиипри ТДР, подтверждает вывод, что они отражают степень выраженноститоксикоза, а следовательно уровень нарушения метаболических процессов.Исходя из вышеизложенного следует предположить, что ИК-спектрысыворотки крови отражают уровень, метаболических нарушений в организме,возникающих под воздействием инфекционного агента. По понятнымпричинам эти изменения не являются специфическими для какого-либоотдельного заболевания, а отражают общие закономерности патогенезаинфекционного процесса.


Литература

1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидовв биологических мембранах. //М.-Наука.-1972.- С. 179.
2. Меерсон Ф.З. и др. Роль ПОЛ в патогенезе ишемического поврежденияи антиоксидантная защита сердца.// Кардиология.-N.2.-1982.-С.81-92.
3. Папаян А.В., Цыбулькин Э.К. Острые токсикозы в раннем детскомвозрасте. // -Л.: Медицина, -1984. -232 с.